Makhyan Jibril A*
*Program Studi Master Ilmu Biomedik, FKUB
1.
PENDAHULUAN
1.1.
Latar Belakang
Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah satu
teknik dasar yang harus dikuasai dalam mempelajari teknik biologi molekular. Tujuan
dari ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah membuang dan memisahkan asam
nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll) sehingga
asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut
dengan teknik biologi molekular lainnya (Corkill dan Rapey, 2008)
Saat ini kita dapat menemukan berbagai macam metode ektraksi DNA. Para
peneliti selalu berusaha menyederhanakan tahapan yang digunakan atau mengurangi
jumlah perlakukan. Tahapan atau perlakuan yang terlalu panjang dan terlalu
kompleks sering meningkatkan resiko kegagalan, terutama bagi pemula. Tahapan
atau perlakuan dalam ekstraksi DNA juga dipengaruhi asal sel/jaringan target (Epplen dan Lubjuhn, 1998)
1.2. Tujuan
Untuk
mengetahui proses pelaksanaan ekstraksi DNA.
2.
TINJAUAN PUSTAKA
DNA biasanya diisolasi dari sel dengan menggunakan
metode yang melisiskan sel tetapi mencegah fragmentasi DNA. Langkah ini
biasanya melibatkan EDTA (ethylenediaminetetraacetic
acid) yang dalam proses tersebut akan mengikat ion magnesium (kofaktor yang
dibutuhkan oleh enzim DNase). Idealnya dinding sel (jika ada) didigesti secara
enzimatis (misalnya dengan enzim lisosim). Selanjutnya membran sel sebaiknya
disolubilisasi dengan detergen. Jika disrupsi fisik dibutuhkan sebaiknya
dilakukan seminim mungkin. Dalam proses disrupsi ini enzim nuklease yang
terlepas dari komponen selular dapat mencerna asam nukleat secara efisien,
sehingga kerja enzim nuklease harus dihambat. Disrupsi sel dan sebagian besar
langkah selanjutnya sebaiknya dilakukan pada suhu 4 0C, menggunakan
alat yang terbuat dari gelas dan larutan yang telah di-autoclave (fungsi
autoclave adalah untuk menghancurkan aktivitas DNase pada alat atau larutan
tersebut). Setelah melepaskan asam nukleat dari sel, RNA dapat dihilangkan
dengan penambahan RNase yang telah diterapi panas untuk menginaktivasi DNase
kontaminan (RNase relatif stabil terhadap panas karena adanya ikatan disulfida
yang akan menyebabkan proses renaturasi ketika didinginkan). Kontaminan mayor
lainnya, yaitu protein, dihilangkan dengan dengan larutan fenol atau campuran
fenol-khloroform (keduanya akan mendenaturasi protein tetapi tidak
mendenaturasi asam nukleat). Setelah campuran tersebut dibuat menjadi emulsi,
dilakukan pemusingan. Setelah pemusingan akan terbentuk bagian organik di
bagian bawah dan bagian aqueous di bagian atas dipisahkan lapisan yang terdiri
dari protein yang terdenaturasi. Cairan aqueous diambil dan dideproteinisasi
beberapa kali sampai tidak ada lagi material yang terlihat pada lapisan tengah.
Kemudian DNA yang sudah tidak mengandung protein ini dicampur dengan dua bagian
etanol. DNA akan menjadi presipitat, terpisah dari larutan sampel tersebut.
Setelah dipusingkan, pelet DNA kemudian dilarutkan kembali (Epplen dan Lubjuhn, 1998).
Secara umum mekanisme isolasi total DNA seluler secara konvensional adalah
sebagai berikut (Corkill dan Rapey, 2008):
1)
homogenisasi sel/jaringan (dalam suhu 4 0C,
semua bahan dan peralatan steril)
2)
lisis seluler (dengan detergen atau
lisosim)
3)
penambahan chelating agents: EDTA/sitrat
4)
penambahan proteinase (proteinase K)
5)
ekstraksi fenol (atau fenol-khloroform)
6)
presipitasi alkohol (70% atau 100% etanol)
7)
pelarutan kembali DNA, misalnya dengan
bufer TE (Tris-EDTA)
Beberapa senyawa mempunyai fungsi multipel dalam
protokol ekstraksi asam nukleat. Agen chaotropic
seperti GuSCN (guanidine isothiocyanate),
NaI (sodium iodide), dan LiCl (lithium chloride) memiliki kemampuan
untuk menghancurkan kapsul lemak dan merusak integritas sel, denaturasi protein
dan menginaktivasi nuklease. GuSCN dengan molaritas di atas 4 M dapat
mempresipitasi DNA dan RNA berberat molekular tinggi. Dalam lingkungan yang
tinggi garam chaotropic ini senyawa
silika dapat berikatan secara spesifik dengan molekul DNA dan RNA, sedangkan
lemak dan protein kontaminan hanya mempunyai afinitas yang moderat terhadap
silika sehingga dapat dicuci bersih darinya. Absorbsi asam nukleat pada matriks
silika meningkat pada pH asam dan konsentrasi garam yang tinggi, sehingga
larutan bufer yang mengandung pH yang tinggi dan konsentrasi garam yang rendah
dapat digunakan untuk mencuci-lepaskan asam nukleat dari matriks silika. Cara
lain pemanfaatan silika dalam proses ekstraksi asam nukleat adalah dengan
melakukan perubahan kimia pada matriks silika sehingga akan secara spesifik berikatan
dengan protein atau polisakarida (prosesnya berkebalikan dengan penjelasan
sebelumnya). Ekstraksi asam nukleat berbasis silika ini telah menjadi dasar
metode ekstraksi asam nukleat kit komersial. Matriks silika dalam kit komersial
tersebut dapat ditemukan dalam berbagai bentuk, seperti filter (spin column), gel (glassmilk, silica gel),
suspensi (celite, plain-coarse silicate), bahkan partikel
berselubung magnetik (Dynabeads).
Filtrasi, sentrifugasi, atau penggunaan magnet memungkinkan pemisahan asam
nukleat yang berikatan dengan silika dari kontaminasi lemak, karbohidrat dan
protein melalui langkah pembilasan yang multipel. Metode ini juga mendasari
pembuatan alat ekstraksi asam nukleat. Metode alternatif yang berbasis matriks
silika antara lain teknik hibridisasi fragmen asam nukleat yang menggunakan probe yang didesain spesifik yang
melekat pada matriks solid atau bead
magnetik. Kelemahan umum dari teknik penangkapan seperti ini adalah selama
proses pelekatan dan cuci-lepas, dapat terjadi fragmentasi dan hilangnya DNA
target.
DNA juga dapat diisolasi dari organela spesifik atau
partikel virus. Untuk ekstraksi DNA semacam ini sebaiknya dilakukan isolasi
organela target atau virus tersebut terlebih dahulu sebelum dilakukan ekstraksi
DNA-nya karena isolasi DNA target dari campuran DNA (DNA total) relatif sulit.
Jika dibutuhkan isolat DNA dengan kemurnian yang tinggi, DNA dapat dimurnikan
dengan density gradient centrifugation
menggunakan CsCl (Caesium chloride) (Corkill
dan Rapey, 2008).
Untuk memeriksa integritas DNA dapat dilakukan dengan
elektroforesis pada gel agarose. Secara kasar gambaran yang diperoleh dari
elektroforesis pada gel agarose tersebut juga dapat digunakan untuk menaksir
konsentrasi isolat DNA kita. Cara yang lebih akurat untuk mengetahui
konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh adalah dengan menggunakan
spektrofotometer UV. DNA untai tunggal mempunyai koefisien absorbsi 0,027, DNA
untai ganda 0,02 dan RNA 0,025 g per-ml per-cm pada panjang gelombang 260 nm.
Rasio absorbsi 260/280 nm dapat digunakan untuk mengetahui adanya kontaminasi
protein atau fenol (protein memiliki absorbsi maksimum pada 280 nm). Sampel DNA
yang murni memiliki rasio 260/280 nm sebesar 1,8-1,9, sedangkan sampel RNA yang
murni 1,9-2,0. Jika rasio tersebut di bawah 1,8 berarti ada ketidakmurnian yang
signifikan yang masih tertinggal di dalam sampel. Saat ini sudah banyak dijual
alat spektrofotometer otomatik yang secara otomatis mengkalkulasi rasio 260/280
nm dan kuantitas asam nukleat. Yang perlu diingat dalam penggunaan
spektrofotometer adalah jangan lupa untuk selalu melakukan kalibrasi dengan larutan
“blank” sebelum memeriksa konsentrasi asam nukleat sampel. Yang digunakan
sebagai “blank” adalah pelarut yang digunakan untuk melarutkan asam nukleat
yang diperiksa (Harisha, 2007)
3. METODE
3.1 Metode Pembuatan
Larutan buffer:
1 .
Genomic Wash buffer1 (GWB 1) = 1 mL PureLink TM genomic wash buffer
1 + 1,5 mL `
1 ethanol
abs. pa.
2. Genomic
Wash buffer 2 (GWB 2) = 0,857mL PureLink TM genomic wash buffer 2 +
2mL
ethanol
abs. pa.
3. Buffer
AW1 = 1,9 mL Buffer AW1 + 2,5 mL ethanol abs. pa.
4. Buffer
AW2 = 1,3 Buffer AW2 + 3 mL ethanol abs. pa.
3.2 Metode Isolasi DNA dari Darah (Fresh or Frozen
Blood) PureLink Genomic DNA Kits
1. 200 µL
darah dimasukkan pada microcentrifuge tube (ependorf) 1,5 mL
2.
Ditambahkan 20 µL proteinase K
3.
Ditambahkan 20 µL RNase A,di vortek
untuk menghomogenkan (tidak boleh lebih 5detik), dan di inkubasi pada RT selama
2 menit
4.
Ditambahkan 200 µL PureLinkTM Genomiclysis/binding buffer,di vortek
untuk menghomogenkan
5.
Diinkubasi pada suhu 55°C selama 10 menit
6.
Dltambah 200 µL ethanol absolute (96-100%) untuk melisiskan dan di vortek untuk
menghomogenkan 5 detik
7.
Dipindahkan pada PureLinkTM spin kolom yang ditaruh diatas
collecting tube
8.
Disentrifuse 12500 rpm selama 1 menit pada RT
9.
DlpindahkanPureLinkTM spinkolom pada collection tube yang bersih lainnya.
10.
Ditambah 500 µL PureLinkTM genomic Wash buffer 1 (GWB 1) yang telah dilarutkan
pada etanol absolut
11.
Disentrifuse 12500 rpm selama 1 menit RT
12.
Dipindahkan PureLinkTM spinkolom pada collection tube yang bersih lainnya
13.
Ditambah 500 µL PureLinkTM genomic Wash buffer 2 (GWB 2) yang Telah dilarutkan
pada etanol absolut
14.
Disentrifuse pada kecepatan max 15000 rpm selama 3 menit RT
15.
Dipindahkan PureLink TM spin kolom pada microcentrifuge tube
(ependof) 1,5 mL yang steril
16.
Ditambah 100 µL PureLink TM genomic elution buffer l
17.
Diinkubasipada RT selama 1 menit
18.
Disentrufuse pada kecepatan max 15000 rpm selama 1 menit pada RT
19.
Disentrufuse pada kecepatan max 15000 rpm selama 1,5 menit pada RT
3.4 Isolasi DNA Dari Bercak Darah Kering (Dry
Blood Spots) QiAamp DNA Micro Kit
1. Siapkan 3 potong bercak darah kering dengan diameter
3 mm dan maeukkan pada 4 tube Mikrosentrifuse
2. Ditambahkan 180 µL Buffer ATL
3. Ditambahkan 20 µL proteinase K dan di vortek untuk
menghomogenkan (tidak boleh lebih 5 detik)
4. Diinkubasi pada suhu 56°C dengan dishaker 900 rpm
selama 1 jam (Seandainya tidakada alatnya, bisa menggunakan heater 56°C dan divortex
selama 10 detik setiap 10menitnya)
5. Disentrifuse sebentar supaya turun kebawah
kira-kira 2500 rpm selama 10 detik
6. Ditambah 200 uL buffer AL dan di vortek untuk selama
10 detik.
7. Diinkubasi pada suhu 70°C dengan dishaker 900 rpm
selama 10 menit (Seandainya tidak ada alatnya, bisa menggunakan heater 70°C dan
divortex selama 10 detik setiap 3 menitnya)
8. Disentrifuse sebentar supaya turun kebawah
kira-kira 2500 rpm selama 10 detik
9. Dipindahkan dengan hati-hati “lysate” (cairan
yang mengandung darah dari bercak darah kering yang terlisiskan) ke dalam kolom
QIAamp MinElute (QM) tanpa membasahi bibir dan disentrifuse 8000 rpm selama 1
menit pada RT. Dipindahkan kolom QM pada collection tube yang bersih lainnya.
10. Ditambahkan 500 µL Buffer AW1 tanpa membasahi bibir.
Dan disentrifuse 8000 rpm selama 1 menit pada RT. Diplndahkan kolom QM pada
collection tube yang bersih lainnya. .
11.Ditambahkan 500 uL Buffer AW2 tanpa membasahi bibir.
Dan disentrifuse 8000 rpm selama 1 menit pada RT. Dipindahkan kolom QM pada
collection tube yang bersihlainnya.
12. Disentrifuse pada kecepatan max (14000 rpm)
selama 3 menit pada RT untuk mengeringkan membrane dengan sempurna
13. Dipindahkan kolom QM pada microcentrifuge tube
(ependof) 1,5mL yang bersih. Ditambahkan 100 µL buffer AE.
14. Diinkubasi pada RT selama 1 menit. Disentrifuse
kecepatan max (14000 rpm) selama 1 menit.
Pembuatan larutan buffer:
4.
KESIMPULAN
Berdasarkan
data dan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa Isolasi DNA dapat dilakukan
baik dari darah segar/ beku (apabila sampel lebih dari 200µL) menggunakan PureLink
Genomic DNA Kits dan Bercak Darah Kering (Dry Blood Spots, jumlah sampel hanya
10µL) dengan QiAamp DNA Micro Kit.
DAFTAR
PUSTAKA
Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of
Nucleic Acids: Basic Tools and Techniques. In: Molecular Biomethods Handbook
Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.
Epplen, J.E., dan T. Lubjuhn. 1999. DNA profiling and
DNA fingerprinting. Birhkhauser Verlag, Berlin.
Harisha, S. 2007. Biotechnology procedures and
experiments handbook (An introduction to biotechnology).Infinity Science Press
LLC. Hingham, MA. Canada.
