ELEKTROFORESIS SDS PAGE
Makhyan Jibril A*
*Program Studi Magister Ilmu Biomedik FKUB
1.
PENDAHULUAN
1.1.
Latar Belakang
Elektroforesis merupakan
metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peneliti yang berkaitan
dengan genetika ataupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin
pesat dinegara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu
pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya
adalah pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang
Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode
elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian
di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Metode
elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian
yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik
terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal
ini termasuk juga protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai
arti transport atau perpindahan melalui partikelpartikel listrik. Metode elekroforesis
telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di
bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di
zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan
sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode
elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan
ataupun tumbuhan.
1.2.
Tujuan
Untuk
mengetahui proses pelaksanaan elektroforesis dan cara
penggunaanya.
2.
TINJAUAN PUSTAKA
Elektroforesis
merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik.
Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan,
bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk
separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang
terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,
ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk
makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi
karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis
biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-mulekul
biologi. Media penyangganya bermacam-macam
tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga
yang seringdipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose,
asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang
banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.
Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein
yakni: (Soedarmadji, 1996)
1. Ukuran molekul protein
Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada
migrasi molekul berukuran kecil.
2. Konsentrasi gel
Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat
daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.
3. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium
pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa
protein yang bermuatan.
Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas
sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul
protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik
akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.
4. Medium penyangga
Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia
inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap
yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul
seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).
1. Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka
molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik,
sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya
pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel
poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid.
5. Kekuatan voltase
2. Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi
molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.
3. Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul
meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah
serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik).
6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika
temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya
jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein. Pada
saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju
elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada
berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein
bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih
besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah
(Sumitro et al., 1996).
Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang
terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk
dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai
berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan
dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat
bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan
ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau
berdekatan (Soedarmadji, 1996).
3.
MATERI DAN METODE
3.1
Alat yang digunakan
Alat yang
digunakan dalam metode elektroforesis adalah tabung eppendorf, mikropipet,
mortar, tabung erlenmeyer, gelas ukur, penangas air (dengan suhu 800C), magnetic
stirer, magnetic bar, sentrifuga, pinset, timbangan, pompa vacum, citakan gel
20x16x1 cm3, timer, meja pendingin, pembungkus plastik, freezer, kawat halus, inkubator,
power supply, pisau, penggaris, spidol, kantong plastik tebal, nampan plastik,
spon.
3.2 Bahan
Running/Main Gel
|
12.5%
|
10%
|
15%
|
||
No
|
Bahan
|
1slap (μL)
|
2slap (μL)
|
1slap (μL)
|
1slap (μL)
|
1.
|
Acrylamide 30%
|
2063
|
4126
|
1650
|
2470
|
2.
|
Tris HCl 1.5 M pH 8.8
|
1250
|
2500
|
1250
|
1250
|
3.
|
Sterile aquades
|
1635
|
3270
|
2050
|
1230
|
4.
|
SDS 10%
|
50
|
100
|
50
|
50
|
5.
|
APS 10%
|
50
|
100
|
12.5
|
12.5
|
6.
|
Temed
|
10
|
20
|
10
|
10
|
Stacking Gel 3%
|
12.5%
|
10%
|
15%
|
||
No
|
Materials
|
1 slap (μL)
|
2slap (μL)
|
1slap (μL)
|
1slap (μL)
|
1.
|
Acrylamide 30%
|
257.5
|
515
|
412
|
620
|
2.
|
Tris HCl 1 M pH 6.8
|
312.5
|
625
|
625
|
625
|
3.
|
Sterile aquades
|
662.5
|
1325
|
1425
|
1220
|
4.
|
SDS 10%
|
12.5
|
25
|
25
|
25
|
5.
|
APS 10%
|
3.75
|
7.5
|
7.5
|
7.5
|
6.
|
Temed
|
2.5
|
5
|
5
|
5
|
3.3. Metode
1. Pembuatan gel
Cara pembuatan
gel adalah dengan melarutkan gel bubuk yang khusus digunakan untuk elektroforesis
pada erlenmeyer,pada kesempatan ini yakni gel poliakrilamida (PAGE = polyacrilamida
gel electrophoresis) kemudian di cetak pada cetakan khusus yang telah
disediakan dan ditunggu hingga kering. Dalam pembuatan agar, proporsi campuran
antara agar dan pelarutnya harus sesuai, karena kalau tidak maka substratnya
tidak akan dapat berjalan
2. Penempatan sampel
Gel dilepaskan
dari cetakan gel dengan cara mengiris keliling tepi gel dengan menggunakan
pisau. Bagian ujung gel diiris atau dibuat sumuran dengan cetakan khusus kira 2
cm dari salah satu tepi yaitu dari arah katoda yang sebagai penyimpan ekstrak
enzim. Sampel yang akan diuji dikeluarkan dari freezer dan dibiarkan sebentar
hingga mencair. Isi pada gel yakni 1) marker 2) H. pillory
pilli, 3) Shigella dysentery pilli, 4) Shigella dysentery OMP, 5) S. typhi
pilli (potongan 1), 6) S. typhi (potongan 2), 7) S. typhi OMP, dan 8) protein
enterosit. Sebagai indikator adanya pergerakan maka celah irisan gel tersebut
diberikan sedikit biru brom fenol.
3. Proses Elektroforesis
Gel yang telah
siap kemudian diletakkan secara horizontal diatas kotak elektroforis yang telah
berisi larutan penyangga elektroda. Proses ini dilakukan di dalam lemari
pendingin dengan suhu 40C. Kedua sisi gel diberi spons yang telah dibasahi
dengan larutan penyangga elektroda sebagai jembatan anatar larutan penyangga
elektroda dengan gel. Setelah itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut
diberi gel yang dingin. Proses elekrofororsis dijalankan dengan memberi daya
listrik pada gel. Pemberian daya listrik disesuaikan dengan sampel yang akan digunakan,
misalnya sebesar 120 V selama kurang lebih 3 jam. Setelah terlihat bahwa biru brom fenol
mencapai titik yang berjarak ± 3 cm dari ujung gel, maka proses elekrofororsis
dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai dipotong, sedangkan potongan gel
yang menjadi tempat migrasi enzim diiris tipis secara horizontal dengan
menggunakan gergaji yang berkawat tipis. Gel diiris menjadi beberapa lembar gel
yang kemudian setiap lembar gel yang diletakkan dalam wadah plastik, untuk
selanjutnya diwarnai dengan pewarnaan commasie brilliant blue
4. Metode Analisis
Dalam hal ini
cara menganalisa hasil pita dari elektroforosis tersebut sangat tergantung dari
topik apa yang akan diteliti. Hasil visualisasi enzim berupa binti atau noda
yang disebut pola pita (bandmorp). Macam pola pita dibedakan atas tipe pola pita
yang terbentuk. Semua tipe pola pita yang terbentuk diinterpretasikan sebagai lokus
isozim dan alel yang kemudian dijadikan dasar dalam pengukuran parameter yanga ada dalam suatu populasi.
Gambar 1. Contoh Hasil Pita Protein
yang Terbentuk
DAFTAR
PUSTAKA
Pratiwi, R.
2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1. Balitbang Biologi
Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta
Sudarmadji, S.,
1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama.Liberty. Yogyakarta.
Sumitro, S. B,
Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus Teknik-Teknik
Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA Universitas
Brawijaya. Malang
Zubay, G. L.
1989. Biochemistry 2nd Edition. Mcmillan Publishing Coorporation. New
York
