Metode Immunohistokimia
Makhyan Jibril Al Farabi*
*Program Study Master Biomedik, FKUB
1.
PENDAHULUAN
1.1.
Latar Belakang
Imunohistokimia
merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau
kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan. Pewarnaan sediaan jaringan
menimbulkan ikatan antibodi pada antigen di permukaan atau didalam sel
yang selanjutnya dapat dideteksi dengan cara dilabel dengan enzim,isotop, fluoropore,atau
coloidal gel. Untuk mempelajari morfologi sel, sel dalam jaringan
difiksasi kemudian dilokalisasi diantara sel dan divisualisasikan
denganmikroskop elektron atau mikroskop cahaya (Rantam, 2003) Teknik
imunohistokimia dapat digunakan untuk mempelajari distribusi enzim yang spesifik pada struktur sel intak (normal/lengkap),mendeteksikomponen sel, biomakromolekul seperti protein,
karbohidrat (Lehr et al., 1999). Dengan demikian, maka sangat
penting sekali untuk memahami teknik imunohistokimia guna penelitian yang
berkaitan dengan pengukuran ekspresi protein, karbohidrat maupun antigen lain di
permukaan maupun di dalam sel.
1.2. Tujuan
Untuk
mengetahui proses pelaksanaan metode immunohistokimia
2.
TINJAUAN PUSTAKA
Imunohistokimia merupakan proses untuk mendeteksi antigen (protein,
karbohidrat, dsb) pada sel dari jaringan dengan prinsip reaksi antibody yang
berikatan terhadap antigen pada jaringan. Nama imunohistokimia diambil dari
nama “immune” yang menunjukkan bahwa prinsip dasar dalam proses ini ialah
penggunaan antibody dan “histo” menunjukkan jaringan secara mikroskopis. Imunohistokimia
seringkali digunakan untuk mengukur dan mengidentifikasi karakteristik dari
even seluler seperti proses proliferasi sel, apoptosis sel. Imunohistokimia juga sering digunakan untuk
penelitian dasar dalam rangka mengetahui distribusi dan lokasi biomarker ataupun
protein terekspresi pada berbagai macam jaringan pada tubuh. (Ramos-Vara,
2005). Untuk memvisualisasikan hasil interaksi antara antigen dan antibody
dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, dimana cara yang paling sering
digunakan ialah dengan konjugasi antibody dengan enzim seperti peroksidase. Selain
itu juga bias digunakan fluorophore seperi fluorescin atau rhodamin. Untuk
mempelajari morfologi sel, sel dalam jaringan difiksasi kemudian
dilokalisasi diantara sel dan divisualisasikan dengan mikroskop elektron atau
mikroskop cahaya (Rantam, 2003)
Secara garis besar,
untuk metode imunohistokimia, dapat dilakukan dengan metode direct maupun
indirect. Dimana keduanya ditentukan oleh prinsip reaksi antibody yang
digunakan, yakni:
Metode Direct
Metode imunohistokimia direct menggunakan antibody primer yang sudah terlabel dan berikatan langsung dengan antigen target secara langsung
Metode Indirect
Metode imunohistokimia indirect menggunakan antibody
primer yang tidak ada labelnya, namun digunakan juga antibody sekunder yang sudah
memiliki label dan akan bereaksi dengan IgG dari antibody primer.
3. METODE
Rangkaian pemeriksaan
Immunohistokimia dimaulai dengan pengambilan sampel lalu pembuatan paraffin
block. Setelah itu dilakukan pewarnaan imunohistokimia. Berikut perinciannya :
a.
Pembuatan paraffin block
1.
Jaringan dicuci dengan PBS
2.
Difiksasi dengan formalin 10%
3.
Dilakukan dehidrasi menggunakan alcohol bertingkat (30%, 50%, 70%,
80%, 96% dan absolute)
4.
Clearing menggunakan xilol 2 kali, masing-masing 60 menit.
5.
Infiltrasi menggunakan paraffin lunak selama 60 menit pada suhu 480C.
6.
Block dalam paraffin keras pada cetakan dan diamkan selama sehari.
7.
Tempelkan. Pada holder dilakukan pemotongan setebal 4-6 mm dengan
rotary microtome.
8.
Mounting pada objek dengan gelatin 5%
b.
Proses deparafinisasi
1.
Slide direndam xilol 2 kali, masing-masing selama 5 menit.
2.
Rehidrasi menggunakan alcohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96%
dan absolute) masing-masing 5 menit
3.
Bilas dengan dH2O selama 5 menit
c.
Proses imunohistokimia terhadap eNOS
1.
Slide preparat dicuci dengan PBS pH 7,4
2.
Aplikasikan 3% h2o2 (daco, Inc) selama 10 menit.
3.
Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali
4.
Blocking menggunakan serum 2% BSA (Sigma USA) selama 60 menit (1%)
5.
Inkubasi dengan antibody primer mouse monoclonal vcam-1 human
absorbed semalam pada suhu 40C (1:100)
6.
Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali
7.
Tetesi dengan anti body sekunder berlabel biotin (Santa Crus) dan
inkubasi selama 1 jam (1:200)
8.
Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali
9.
Tetesi dengan SA-HKP (Strep Avidin horse radis peroxidase)
(Dako,Inc) selama 40 menit (1:500)
10.
Cuci dengan PBS pH 7,4
selama 5 menit 3 kali
11.
Aplikasikan cromogen untuk
HRP yaitu DAB (Diamono Benzidine) (Daco,Inc)
12.
Bilas dengan H2O
13.
Cuci dengan PBS pH 7,4
selama 5 menit 3 kali
14.
Counter straining dengan
mayer Hematoxilen (lab Vision) selama 10 menit
15.
Cuci dengan tap Water
16.
Kering anginkan dan
mounting menggunakan entelan serta cover Glass
d.
Pembuatan media
Larutan PBS
a.
Na H2 PO4 2 H2O 2,4 gram
b.
Na2HPO4 1,2
gram
c.
KH2PO4 0,7 gram
d.
KCI 6,8 gram
Pembuatan
-
Dilarutkan ke 3 bahan tersebut dengan aquadest sampai 1 L
-
Diletakkan di atas magnetic stirrer agar homogen
-
Diukur pada pH 7,4. Distrilisasi
-
Simpan disuhu dingin
-
Jika ingin diencerkan, ambil 100 cc, tambahkan 900 mL Aquades
4. HASIL
5.
KESIMPULAN
Berdasarkan
data dan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa imunohistokimia merupakan
metode semi-kuantitatif yang bermanfaat untuk mempelajari distribusi enzim yang
spesifik pada struktur sel intak (normal/lengkap), biomakromolekul seperti
protein, karbohidrat dengan prinsip prinsip immunoassay.
DAFTAR
PUSTAKA
Lehr S, Kotzka J, Herkner A, Klein E, Siethoff C,
Knebel B, Noelle V, Brüning JC, Klein HW, Meyer HE, Krone W, Müller-Wieland D.
1999. Identification of tyrosine
phosphorylation sites in human Gab-1 protein by EGF receptor kinase in vitro.
Biochemistry. Jan 5;38(1):151-9.
Ramos-Vara, JA. 2005. "Technical Aspects of Immunohistochemistry". Vet Pathol
42 (4): 405–426. doi:10.1354/vp.42-4-405. PMID 16006601.
Rantam, Fedik A. 2003. Metode Immunologi. Airlangga
University Press. Surabaya. 145-155
