Kombinasi Penggunaan Promotor CMV dengan P2A dalam Meningkatkan Ekspresi mRNA SNAIL

Kombinasi Penggunaan Promotor CMV dengan P2A dalam Meningkatkan Ekspresi mRNA SNAIL

(Ringkasan Hasil Penelitian Singkat di Krakow, Polandia)

Oleh: Makhyan Jibril A

Pertama tama saya akan menceritakan terkait teknologi enzim restriksi dan isolasi DNA. Dalam rangka isolasi suatu gen yang terdapat dalam sebuah construct yang sudah jadi, diperlukan suatu pendekatan yakni dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi akan berperan untuk memotong DNA sirkuler pada titik titik tertentu yang sesuai sehingga DNA tidak menjadi sirkuler lagi dan dapat di isolasi sekuens spesifik yang kita inginkan. Enzim restriksi sendiri memiliki banyak tipe dan site reaksi, sehingga kita dapat menyesuaikannya dengan kebutuhan.

Dengan model konstruk seperti demikian, maka untuk mengisolasi gen serulean CFP dibutuhkan enzim restriksi bernama BamHI dan BclII. Dalam hal ini enzim tersbut akan bekerja untuk menghasilkan dua potong gen, yakni dengan 4000bp dan 500 bp. Untuk mengkonfirmasi apakah enzim restriksi telah bekerja dengan sempurna, digunakan metode elektroforesis horizontal dengan label ethidium bromide yang nantinya akan membuat gel hasil elektroforesis berpendar. Selanjutnya dengan pemberian DNA ladder, maka kita bisa membandingkan dan memperkirakan panjang basepair dari DNA hasil digesti enzim. Pada kondisi tersbut, kita bisa mengisolasi secara spesifik gen yang panjang basepairnya yang kita inginkan. Kami berhasil mengisolasi gen yang kami inginkan dengan memotong gel yang berisi sekuens basepair DNA yang terpanjang. Gel yang berbahan dari xxx ini perlu dilembekkan dengan waterbath dengan suhu 55° C untuk selanjutnya dilakukan reaksi PCR dengan primer forward dan reverse yang sesuai untuk ceruleanCFP. Hal ini dilakukan untuk mengamplifikasi jumlah DNA spesifik pada sekuens tersebut, sehingga didapatkan jumlah DNA yang mencukupi untuk digunakan dalam reaksi rekombinan.

Mesin Imaging hasil Elektroforesis

Pada dasarnya, prinsip PCR ialah dengan cara denaturasi dari DNA sehingga DNA menjadi single strand pada suhu 90°,selanjutnya Primer forward dan reverse akan bekerja bersama DNA polymerase untuk sintesis DNA baru dengan bahan dNTP (Paket nukleotida yang dibutuhkan untuk membentuk DNA,  terdiri dari AUGC) pada suhu 60°. reaksi diakhiri dengan menurunkan suhu secara cepat menjadi 4°C untuk menghentikan reaksi.

Pada kesempatan ini, kita juga berkesampatan untuk menyaksikan reaksi rekombinan GFP-P2A-SNAIL. Salah satu proses rekombinan yang unik karena disini digabungkan 3 sekuens DNA yang memiliki fungsinya masing-masing. GFP merupakan protein label yang sering digunakan untuk mengevaluasi eksrpresi dari protein yang dipasangkan dengannya melalui mikroskop fluoresens. P2A merupakan suatu protein yang mampu di digesti oleh enzim yang diproduki ER sehingga nantinya GFP akan terpisah dengan SNAIL. Sedangkan SNAIL sendiri merupakan salah satu factor transkripsi yang berperan dalam pathogenesis kanker.

Dalam konstruksi GFP-P2A-SNAIL. Dilakukan berbagai macam tahapan. Diawali dengan kombinasi sekuens antara GFP dengan sekuens P2A. sekuens ini dibuat sedemikian sehingga memiliki 5’ sticky end pada sekuens GFP dengan flanking region AttB, sdangkan P2A memiliki 3’sticky end dengan Multisite. Pada penelitian ini juga dibandingkan antara penggunaan promotor CMV dengan Ubiquitin. Setelah sel ditransfeksikan kepada kultur sel kanker otot, sel diamati dengan mikroskop fluoresens. Dapat diamati bahwa sel yang ditransfeksikan dengan GFP,GFP-SNAIL,maupun GFP-P2A-SNAIL mengalami peningkatan intensitas warna hijau yang dihasilkan. Pada kasus ini dibandingkan antara GFP-P2A-SNAIL yang menggunakan promotor ubiquitin dengan CMV dan didapatkan bahwa CMV memiliki kemampuan promotor yang lebih kuat ditandai dengan tingginya intensitas fluoresensi sel.

Untuk memastikan apakah memang terjadi peningkatan mRNA dari masing masing gen yang dikonstruksi. Maka dilakukan reaksi RT-PCR yang bertujuan untuk mengukur fluoresensi DNA  yang terbentuk setelah dilakukan reaksi PCR berkali kali. Proses ini nantinya akan merekam jumlah total DNA yang dihasilkan dari primer yang sesuai dengan reaksi, pada kesempatan ini kita mengevaluasi ekspresi factor transkripsi SNAIL. Didapatkan bahwa factor transkripsi SNAIL mengalami peningkatan yang signifikan pada kelompok promotor CMV, maupun pada vector yang dibentuk dengan P2A maupun tanpa P2A. hal ini membuktikan bahwa factor CMV ialah promotor yang poten, sekaligus pemberian P2A tidak akan menurunkan ekspresi SNAIL. Dengan demikian, P2A mampu menjadi kandidat pemisah protein target dengan GFP pasca transkripsi.

Read More