Kombinasi Penggunaan Promotor CMV dengan P2A dalam Meningkatkan Ekspresi mRNA SNAIL
(Ringkasan Hasil Penelitian Singkat di Krakow, Polandia)
Oleh: Makhyan Jibril A
Pertama tama saya akan menceritakan terkait teknologi
enzim restriksi dan isolasi DNA. Dalam rangka isolasi suatu gen yang terdapat
dalam sebuah construct yang sudah jadi, diperlukan suatu pendekatan yakni
dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi akan berperan untuk
memotong DNA sirkuler pada titik titik tertentu yang sesuai sehingga DNA tidak
menjadi sirkuler lagi dan dapat di isolasi sekuens spesifik yang kita inginkan.
Enzim restriksi sendiri memiliki banyak tipe dan site reaksi, sehingga kita
dapat menyesuaikannya dengan kebutuhan.
Dengan model konstruk seperti demikian, maka untuk
mengisolasi gen serulean CFP dibutuhkan enzim restriksi bernama BamHI dan
BclII. Dalam hal ini enzim tersbut akan bekerja untuk menghasilkan dua potong
gen, yakni dengan 4000bp dan 500 bp. Untuk mengkonfirmasi apakah enzim
restriksi telah bekerja dengan sempurna, digunakan metode elektroforesis
horizontal dengan label ethidium bromide yang nantinya akan membuat gel hasil
elektroforesis berpendar. Selanjutnya dengan pemberian DNA ladder, maka kita
bisa membandingkan dan memperkirakan panjang basepair dari DNA hasil digesti
enzim. Pada kondisi tersbut, kita bisa mengisolasi secara spesifik gen yang
panjang basepairnya yang kita inginkan. Kami berhasil mengisolasi gen yang kami
inginkan dengan memotong gel yang berisi sekuens basepair DNA yang terpanjang.
Gel yang berbahan dari xxx ini perlu dilembekkan dengan waterbath dengan suhu
55° C untuk selanjutnya dilakukan reaksi PCR dengan primer forward dan reverse
yang sesuai untuk ceruleanCFP. Hal ini dilakukan untuk mengamplifikasi jumlah DNA spesifik pada sekuens tersebut, sehingga
didapatkan jumlah DNA yang mencukupi untuk digunakan dalam reaksi rekombinan.
|
Mesin Imaging hasil Elektroforesis
|
Pada kesempatan ini, kita juga berkesampatan untuk
menyaksikan reaksi rekombinan GFP-P2A-SNAIL. Salah satu proses rekombinan yang
unik karena disini digabungkan 3 sekuens DNA yang memiliki fungsinya
masing-masing. GFP merupakan protein label yang sering digunakan untuk
mengevaluasi eksrpresi dari protein yang dipasangkan dengannya melalui
mikroskop fluoresens. P2A merupakan suatu protein yang mampu di digesti oleh
enzim yang diproduki ER sehingga nantinya GFP akan terpisah dengan SNAIL.
Sedangkan SNAIL sendiri merupakan salah satu factor transkripsi yang berperan
dalam pathogenesis kanker.
Dalam konstruksi GFP-P2A-SNAIL. Dilakukan berbagai macam
tahapan. Diawali dengan kombinasi sekuens antara GFP dengan sekuens P2A.
sekuens ini dibuat sedemikian sehingga memiliki 5’ sticky end pada sekuens GFP
dengan flanking region AttB, sdangkan P2A memiliki 3’sticky end dengan Multisite.
Pada penelitian ini juga dibandingkan antara penggunaan promotor CMV dengan
Ubiquitin. Setelah sel ditransfeksikan kepada kultur sel kanker otot, sel
diamati dengan mikroskop fluoresens. Dapat diamati bahwa sel yang
ditransfeksikan dengan GFP,GFP-SNAIL,maupun GFP-P2A-SNAIL mengalami peningkatan
intensitas warna hijau yang dihasilkan. Pada kasus ini dibandingkan antara
GFP-P2A-SNAIL yang menggunakan promotor ubiquitin dengan CMV dan didapatkan
bahwa CMV memiliki kemampuan promotor yang lebih kuat ditandai dengan tingginya
intensitas fluoresensi sel.
Untuk memastikan apakah memang terjadi peningkatan
mRNA dari masing masing gen yang dikonstruksi. Maka dilakukan reaksi RT-PCR
yang bertujuan untuk mengukur fluoresensi DNA
yang terbentuk setelah dilakukan reaksi PCR berkali kali. Proses ini
nantinya akan merekam jumlah total DNA yang dihasilkan dari primer yang sesuai
dengan reaksi, pada kesempatan ini kita mengevaluasi ekspresi factor
transkripsi SNAIL. Didapatkan bahwa factor transkripsi SNAIL mengalami
peningkatan yang signifikan pada kelompok promotor CMV, maupun pada vector yang
dibentuk dengan P2A maupun tanpa P2A. hal ini membuktikan bahwa factor CMV
ialah promotor yang poten, sekaligus pemberian P2A tidak akan menurunkan
ekspresi SNAIL. Dengan demikian, P2A mampu menjadi kandidat pemisah protein
target dengan GFP pasca transkripsi.
